https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0269749122004560#bib46
Terje Svingen; Camilla Lindgren Schwartz; Anna Kjerstine Rosenmai; Louise Ramhøj; Hanna Katarina Lilith Johansson; Ulla Hass; Monica Kam Draskau; Nichlas Davidsen; Sofie Christiansen; Anne-Sofie Ravn Ballega e Marta Axelstad
Instituto Nacional de Alimentos, Universidade Técnica da Dinamarca, Kgs. Lyngby, DK-2800, Dinamarca
Recebido em 20 de janeiro de 2022, revisado em 12 de março de 2022, aceito em 29 de março de 2022, disponível on-line em 1 de abril de 2022, versão do registro em 5 de abril de 2022 .
Destaques
• Métodos alternativos substituirão cada vez mais os estudos em animais para testes de toxicidade.
• A toxicologia preditiva requer conhecimento dos mecanismos de ação.
• Os produtos químicos disruptores endócrinos podem ter vários modos de ação.
• A estrutura AOP é adequada para avaliar os disruptores endócrinos.
• As tecnologias de células-tronco baseadas em humanos são uma grande promessa para a identificação de perigos.
Resumo
Os produtos químicos disruptores endócrinos (EDCs/endocrine disruptors chemicals) são uma questão de grande preocupação. Eles são onipresentes no meio ambiente, são considerados prejudiciais aos seres humanos e à vida selvagem, mas continuam sendo um desafio identificá-los com base nas atuais diretrizes de testes internacionais e estruturas regulatórias. Para que um composto seja identificado como um EDC dentro do sistema regulatório da União Europeia, deve ser estabelecida uma ligação plausível entre um modo de ação endócrino e um efeito adverso em um organismo intacto. Isso requer um conhecimento aprofundado sobre as vias moleculares que regulam o desenvolvimento e a função normal em animais e humanos, a fim de elucidarem as causas das doenças. Embora nosso conhecimento sobre o papel do sistema endócrino no desenvolvimento e função animal seja substancial, continua sendo um desafio prever resultados de doenças endócrinas em animais intactos com base em dados de testes não animais. A principal razão para isso é que nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação ainda carece de componentes causais essenciais, juntamente com o grande desafio de imitar o complexo sistema endócrino de múltiplos órgãos por reducionismo metodológico. Aqui, destacamos esse desafio ao extrair exemplos da toxicidade reprodutiva masculina, que é uma área que tem estado na vanguarda da pesquisa de EDC desde o seu início. Discutimos a importância de maior foco na caracterização do mecanismo de ação para efeitos adversos à saúde induzidos por EDC. Isso é para que possamos projetar estratégias de teste mais robustas e confiáveis usando métodos de teste sem animais para predição destacamos esse desafio ao extrair exemplos da toxicidade reprodutiva masculina, que é uma área que tem estado na vanguarda da pesquisa de EDC desde seu início. Discutimos a importância de maior foco na caracterização do mecanismo de ação para efeitos adversos à saúde induzidos por EDC. Isso é para que possamos projetar estratégias de teste mais robustas e confiáveis usando métodos de teste não animais para uma toxicologia preditiva; tanto para melhorar a avaliação de riscos químicos em geral, mas também para permitir uma considerável redução e substituição de experimentos com animais em testes químicos do século XXI.
Resumo gráfico
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1 . Introdução
A toxicologia moderna está lidando com a perspectiva de proteger melhor a saúde humana contra produtos químicos nocivos e, ao mesmo tempo, reduzir o uso de animais para testes químicos (Pistollato et al., 2021). No que diz respeito aos produtos químicos disruptores endócrinos (EDCs), isso continua sendo um desafio, pois, em muitos casos, não entendemos suficientemente o nexo causal entre as interações químicas com biomoléculas e os resultados dos efeitos em organismos intactos. Ao confiar em métodos de teste não animais para prever resultados de efeitos in vivo, o conhecimento a priori sobre as relações causais entre o que está sendo medido (por exemplo, in vitro ou in silico) e os resultados adversos (in vivo) deve ser robusto; e aqui reside um dos grandes desafios de substituir os testes em animais por métodos alternativos de teste. Pode ser difícil prever, com precisão razoável, os potenciais efeitos adversos que um produto químico pode ter na saúde humana, a menos que tenhamos certeza de que usamos os métodos alternativos corretos e interpretamos os dados adequadamente. Assim, há uma forte necessidade de estabelecer um sólido conhecimento mecanicista das relações causais para permitir o uso de métodos de teste alternativos corretos para fins de teste.
Embora muitos mecanismos/modos de ação tenham sido estabelecidos para a desregulação endócrina, continua sendo difícil prever resultados in vivo a partir de dados de métodos alternativos com alta precisão. As razões para isso são muitas e obviamente incluem parâmetros toxicocinéticos complexos (absorção, distribuição, metabolismo e excreção; ADME), mas também janelas sensíveis de exposição, diferenças de espécie para espécie, diferenças de sexo, compreensão quantitativa das relações dose-resposta e assim por diante. adiante. Provavelmente também inclui mecanismos de ação adicionais aos que normalmente são testados. Atualmente, os modos de ação mais comuns que são considerados ao avaliar se um produto químico tem propriedades desreguladoras endócrinas (ED/endocrine disrupter) são estrógeno, andrógeno, tireoide e esteroidogênese, as chamadas modalidades EATS/estrogen, androgen, thyroid, and steroidogenesis (EFSA/ECHA et al., 2018; Kucheryavenko et al., 2020). Reconhece-se que a interrupção de outras modalidades não EATS pode causar efeitos adversos por um modo de ação endócrino (EFSA/ECHA et al., 2018; Grignard et al., 2020 ; Martyniuk et al., 2021); no entanto, as modalidades EATS são os caminhos para os quais temos o melhor conhecimento mecanicista e causal em relação aos resultados adversos causados pela desregulação endócrina. Eles também são as modalidades, ou vias, para as quais temos algumas diretrizes de teste padronizadas para testes in vitro e in vivo (EFSA/ECHA et al., 2018).
Esta revisão visa ilustrar a importância de caracterizar ainda mais o mecanismo de ação para prever as propriedades de ED, e exemplificaremos isso focando na toxicidade reprodutiva masculina. Isso ocorre porque a toxicidade reprodutiva masculina relacionada à disfunção erétil tem uma longa história de pesquisa com muito conhecimento disponível, além de vários métodos de teste internacionais estabelecidos que estão incluídos no programa de diretrizes de teste internacional (TG/test guidelines) supervisionado pela Organização para Cooperação o e Desenvolvimento Econômico (OCDE). Como tal, a toxicidade reprodutiva masculina pode servir como um caso informado, mas também destacar desafios semelhantes encontrados para outras modalidades de ED.
2 . O que define um EDC?
Embora a definição de um EDC seja assumida por sua nomenclatura descritiva – um produto químico que pode perturbar o sistema endócrino –, na verdade, é um pouco difícil de definir e não há definição(ões) universal(is) aceita(s). O mais amplamente aceito (Solecki et al., 2017), e o aderido nesta revisão, é a definição da Organização Mundial da Saúde (WHO/IPCS, 2002) e os critérios da Comissão Europeia para ‘disrupção endócrina' aplicável a agrotóxicos e biocidas, definidos pela Comissão Europeia (EC, 2017; ECHA/EFSA, 2018). Aqui, uma substância deve atender a todos os três critérios para ser considerada um EDC:
i) deve induzir um efeito adverso em um organismo intacto ou sua progênie;
ii) deve fazê-lo por um modo de ação endócrino, ou seja, altera a(s) função(ões) do sistema endócrino; e
iii) o efeito adverso deve ser uma consequência plausível de um modo de ação endócrino.
Com relação ao primeiro critério, vale a pena notar que “um organismo intacto” pode não ter que ser um animal experimental. Conforme discutido em uma declaração de consenso de 2017 sobre a identificação de EDCs, o termo “organismos intactos” refere-se a uma situação in vivo , que incluiria observações epidemiológicas e clínicas em humanos, além de animais experimentais (Solecki et al., 2017). Os autores do documento de consenso também argumentam que poderia incluir evidências de sistemas de teste alternativos adequadamente validados que são preditivos de efeitos em humanos ou animais selvagens, ou de animais geneticamente modificados ou cirurgicamente incluídos em experimentos focados. No entanto, atualmente não há um consenso final acordado sobre o que constitui um ‘organismo intacto' e, como discutido recentemente, a terminologia ‘animal intacto' não é definida pela IPSC (Vandenberg, 2021). Assim, se animais alterados cirurgicamente ou geneticamente modificados podem ser considerados ‘organismos intactos' ainda está em debate e deve ser melhor esclarecido por entidades como a IPSC. .
Independentemente disso, com os três critérios acima mencionados, torna-se óbvio que não é suficiente para um produto químico interromper a sinalização endócrina ser considerado um EDC. Tampouco é suficiente para causar resultados adversos in vivo que possam ser considerados como originários de disrupção endócrina. Para que este último ponto seja verdadeiro, uma ligação biologicamente plausível também deve ser estabelecida entre o resultado adverso e um modo de ação endócrino. Assim, o conhecimento mecanicista torna-se muito importante; não só para estabelecer uma ligação plausível entre os modos de ação endócrino e os resultados dos efeitos apicais, mas também para garantir que as substâncias químicas sejam testadas utilizando métodos de ensaio alternativos adequados para fornecer os dados necessários para as avaliações de perigos químicos e riscos.
3 . Métodos de teste usados para avaliação da desregulação endócrina relevante para a toxicidade reprodutiva masculina
Os efeitos adversos no sistema reprodutivo ocorrem caracteristicamente após a exposição a substâncias químicas que afetam a sinalização de estrogênio ou androgênio, ou a síntese dos hormônios esteroides (ou seja, modalidades EAS/synthesis of the steroid hormones). Os níveis corretos e a ação dos hormônios esteroides são importantes para o desenvolvimento e funcionamento adequados do sistema reprodutor masculino e feminino, portanto, a exposição a compostos que causam desregulação endócrina pode levar a uma série de efeitos no sistema reprodutivo em ambos os sexos (EFSA/ECHA et al., 2018 ; OCDE, 2018b). Nos machos, a sinalização androgênica é necessária para o desenvolvimento do fenótipo sexual masculino, incluindo o sistema reprodutivo. Se a ação androgênica for inibida durante os estágios críticos do desenvolvimento, o feto masculino não se masculinizará completamente (Jorgensen et al., 2021; Welsh et al., 2008). Por sua vez, essa falha na masculinização completa pode levar a vários distúrbios reprodutivos que se manifestam no nascimento ou mais tarde na vida, como aqueles incluídos na síndrome da disgenesia testicular (SDT): hipospádia e criptorquidia (distúrbios do nascimento); infertilidade e câncer testicular (doença tardia) (Skakkebaek et al., 2016).
Em relação ao desenvolvimento reprodutivo masculino, vários parâmetros in vivo podem ser medidos em estudos de toxicidade em roedores (OECD, 2018b), conforme resumido na Tabela 1. Por exemplo, a distância anogenital (AGD/anogenital distance) e a retenção mamilar (NR/nipple retention) são considerados biomarcadores para masculinização, onde tanto uma AGD masculina curta quanto uma NR na prole masculina indicam desmasculinização causada pela ação incompleta dos andrógenos fetais. Ambos os biomarcadores de efeito são frequentemente afetados após a exposição pré-natal a produtos químicos antiandrogênicos. Assim também são malformações como hipospádia e criptorquidia, que estão ligadas à ação perturbada dos andrógenos, ou a função dos testículos, durante a vida fetal e essas malformações são evidentes ao nascimento. A interrupção do androgênio fetal também pode ter consequências na vida adulta, manifestando-se também com efeitos nos parâmetros do esperma. Esses e outros parâmetros relevantes incluídos nas Diretrizes de Teste da OCDE estão listados na Tabela 1 .
Tabela 1. Parâmetros apicais incluídos em estudos de toxicidade em roedores concebidos para avaliar a toxicidade reprodutiva e os potenciais efeitos reprodutivos masculinos relacionados com a disfunção erétil.
Macho | |||
|---|---|---|---|
| Ponto final | Fase da vida para investigação | Descrição | Ponto final incluído na OCDE TG nº* |
| Distância anogenital (AGD) | Neonatal (PND 1-4) ou gestacional (GD 21-22 na cesariana em TG 414) | A AGD em ratos e camundongos machos é tipicamente duas vezes mais longa que nas fêmeas. Uma AGD masculina mais curta indica masculinização incompleta por ação inadequada de andrógenos durante o final da gestação ( Schwartz et al., 2019 ). Nota: no TG 416 (o estudo de duas gerações) a medição da AGD está incluída como um parâmetro opcional e só é medida na segunda geração (filhotes F2) se for desencadeada por alterações na proporção sexual da primeira geração (F1) ou no momento da relação sexual. maturação | TG 414, TG 421/422, TG 443, TG 416 |
| Retenção do mamilo/aréola (NR) | Nos neonatais (PND 12-14) quando visível em ninhadas femininas | Em roedores comuns de laboratório, os machos não têm mamilos, enquanto as fêmeas normalmente têm 10 (camundongos) ou 12 (ratos). Nos machos, os mamilos regridem devido à sinalização androgênica durante o final da gestação. Assim, quando os machos expressam mamilos, indica masculinização incompleta (Schwartz et al., 2021). | TG 421/422, TG 443 |
| Hipospádia (deslocamento da abertura uretral do pênis) e criptorquidia (testículos não descidos). | Neonatal, pré-puberdade, puberdade e idade adulta ou gestacional (GD 21-22 em cesariana em TG 414) | Malformações genitais, como criptorquidia e hipospádia, estão ligadas à sinalização androgênica interrompida e potencialmente também ao desequilíbrio androgênio-estrogênio na vida fetal (Welsh et al., 2008) (Mattiske & Pask, 2021). Ambas as malformações podem ser avaliadas na prole masculina logo após o nascimento e por volta do PND 16, mas as hipospádias são mais facilmente avaliadas após a maturação sexual. Em fetos pode ser avaliada a indicação de descida testicular incompleta/criptorquidia e observação do sexo externo e interno (gonadal). Nota: no TG 414 isso é feito em fetos após cesariana e no TG 416 apenas um filhote por ninhada é examinado para essas malformações | TG 421/422, TG 443, TG 414 TG 416 |
| Separação prepucial | Puberdade, ratos machos são examinados diariamente para separação prepucial de cerca de 30 dias de idade. Isso consiste em tentativas de retração manual do prepúcio com pressão suave (Korenbrot et al., 1977). | O momento da maturação sexual é controlado por hormônios esteroides e, portanto, pode ser afetado pela exposição aos EDCs. Os efeitos podem ocorrer após a exposição durante a vida perinatal, mas provavelmente serão mais acentuados se a exposição continuar após o desmame e durante o período pré-púbere e puberal. | TG 416, TG 443, TG 426 |
| Peso dos testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminais e os músculos elevador do ânus mais bulbocavernoso (LABC). | Neonatal, pré-puberdade, puberdade, idade adulta | Os pesos absolutos e relativos desses órgãos reprodutores masculinos são sensíveis à sinalização androgênica. Os EDCs antiandrogênicos normalmente resultam em pesos diminuídos, mas os efeitos podem diferir dependendo da idade dos animais, das doses examinadas e dos mecanismos endócrinos dos compostos investigados. Nota: Em vários TGs alguns órgãos reprodutivos são apenas opcionais para pesar nas idades selecionadas | TG 441, TG 407, TG 408, TG 416, TGs 421/422, TG 443 |
| Exame histológico dos órgãos reprodutores masculinos | Neonatal, pré-puberdade, puberdade, idade adulta | A exposição a EDCs (especialmente antiandrogênicos) normalmente causará degeneração da espermatogônia ou do testículo, bem como hiperplasia/hipertrofia das células de Leydig (OECD, 2018a). O efeito na histologia do órgão reprodutor pode diferir dependendo da idade dos animais, das doses examinadas e dos mecanismos endócrinos dos compostos investigados. Nota: em alguns TGs, o exame histológico dos órgãos reprodutores masculinos está incluído como opcional | TG 407, TG 408, TG 416, TG 422, TG 443, TG 451 |
| Qualidade do esperma (contagem de esperma, motilidade e morfologia). | Idade adulta | A exposição a produtos químicos disruptores endócrinos pode afetar a qualidade do esperma. Os efeitos adversos podem se manifestar após a exposição a EDCs durante a vida perinatal, mas provavelmente serão mais acentuados se a exposição continuar durante a puberdade e a idade adulta. | TG 408, TG 416, TG 443 |
Dia de gestação (GD/Gestation day), Dia pós-natal (PND/Postnatal day), Diretriz de teste (TG/Test guideline), Segunda geração (F2);
* visão geral dos números de TG pode ser acessada em https://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-4-health-effects_20745788.
Além dos parâmetros de efeitos adversos listados na Tabela 1 , vários parâmetros adicionais in vivo podem ser avaliados para obter informações relevantes para DE relacionadas aos produtos químicos em estudo. Esses resultados não são pontos finais apicais, mas sim mecanicistas in vivo que podem fornecer conhecimento importante sobre os modos de ação em relação à adversidade observada. Conforme listado na Tabela 2, eles incluem medições de hormônios sexuais esteroides, bem como hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH) no soro, níveis de testosterona intratesticular e alterações transcricionais em órgãos-alvo. Nenhum desses parâmetros é obrigatório nas diretrizes de teste da OCDE e, portanto, são avaliados principalmente em estudos in vivo da academia; no entanto, eles podem ser incluídos em alguns dos GT/gestation day, caso a caso.
Tabela 2 . Parâmetros mecanísticos que são ocasionalmente avaliados em estudos de toxicidade reprodutiva em roedores. Esses pontos finais são opcionais apenas nas atuais Diretrizes de Teste da OCDE. Consequentemente, eles são avaliados com muito menos frequência do que os desfechos de efeitos adversos.
| Ponto final | Fase da vida para investigação | Descrição |
|---|---|---|
| Alterações nas concentrações de testosterona (masculino), estradiol (feminino) e progesterona (feminino) no soro | Pré e neonatal, na pré-puberdade, puberdade e idade adulta | As concentrações de hormônios esteróides no soro podem ser afetadas pela exposição ao EDC. A magnitude e direção das mudanças dependem do EDC que está sendo investigado, suas doses, modos de ação, bem como sexo e idade dos animais avaliados. |
| Alterações na produção de testosterona nos testículos | Neonatal | A produção de testosterona nos testículos fetais pode ser marcadamente diminuída após a exposição pré-natal ao EDC. A testosterona pode ser medida no soro e nos testículos. |
| Alterações nas concentrações de LH e FSH no soro/tecidos | Neonatal, pré-puberdade, puberdade, idade adulta | Em estudos com roedores, as alterações na secreção de gonadotrofinas seriam medidas pós-natal após a ativação do eixo HPG/hipotálamo-pituitária-gonadal. Tanto o LH quanto o FSH podem ser medidos no soro e informar sobre a desregulação sistêmica. |
| Alterações na expressão gênica em órgãos reprodutivos, hipófise ou hipotálamo | Neonatal, pré-puberdade, puberdade, idade adulta | A análise transcricional pode ser realizada em todos os alvos e tecidos relevantes para caracterizar possíveis alterações mediadas pelo sistema endócrino na transcrição gênica. |
Hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo estimulante (FSH), eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG).
Métodos de teste alternativos estão sendo constantemente desenvolvidos para reduzir a necessidade de testes de toxicidade animal de substâncias químicas (Parish et al., 2020). As abordagens incluem vários ensaios in vitro, mas também métodos in silico , como modelos toxicocinéticos de base fisiológica (PBTK) e modelos de relação estrutura-atividade quantitativa (QSAR/quantitative structure-activity relationship) (Judson et al., 2018). Uma grande vantagem desses métodos alternativos é seu potencial de alto rendimento e custo relativamente baixo em comparação com extensos estudos de toxicidade animal, permitindo a triagem de milhares de produtos químicos em um prazo razoável. Por sua vez, dados de métodos alternativos podem ser usados para priorizar compostos para testes in vivo de toxicidade, mas também fornecem evidências para os modos de ação da EDC e contribuem para o peso da evidência nas avaliações de risco químico.
Atualmente, ao usar ensaios in vitro para rastrear potenciais efeitos de EDC através da modalidade A, é necessário incluir todos os mecanismos que são relevantes (e essenciais) para causarem desfechos de efeito apical, conforme listado na Tabela 1. No caso da sinalização androgênica, existem diretrizes de teste in vitro validadas sob a OCDE (Tabela 3) que podem ser usadas para realizar a análise do modo de ação na avaliação de risco químico. Os TGs/test guidelines validados pela OCDE cobrem apenas um subconjunto de parâmetros relevantes, e estão disponíveis vários métodos complementares e alternativos para testar outros modos de ação importantes para o desenvolvimento e função reprodutiva masculina. Por exemplo, ensaio de ligação ao receptor de andrógeno (AR/androgen receptor), ensaio de translocação AR, recrutamento co-regulatório (Kleinstreuer et al., 2017 ; Lynch et al., 2017), inibição de aromatase (CYP19A1) (CompTox_Chemicals_Dashboard) e inibição de 5α-redutase (Kim et al., 2021 ; Srivilai et al., 2016 ; Zheng et al., 2020) estão disponíveis; no entanto, eles ainda precisam ser validados pela OCDE.
Tabela 3 . Diretrizes de teste in vitro da OCDE validadas para testar os efeitos da EDC por modalidades de EAS.
| Ponto final | Nome do ensaio | Descrição | OCDE TG |
|---|---|---|---|
| Ativação ou inibição do gene repórter ligado ao AR | Ensaio de Ativação Transcricional de Receptor de Andrógeno Humano Transfectado Estavelmente para Detecção de Agonista Androgênico e Atividade Antagonista de Produtos Químicos | Três métodos validados para testar a capacidade dos produtos químicos de se ligarem ao AR e levar a alterações nos genes responsivos aos andrógenos em diferentes linhagens celulares: – Linha celular AR-EcoScreen TM – Linha celular AR-CALUX – Linha celular 22Rv1/MMTV_GR-KO Todas as linhas celulares são transfectadas de forma estável com um gene repórter de luciferase responsivo a AR. | TG 458 |
| Interrupção da esteroidogênese/Níveis alterados de estrogênio e testosterona | Ensaio de esteroidogênese H295R | Um método validado para testar a capacidade de produtos químicos para afetar a produção de 17β-estradiol e testosterona em uma linhagem de células de adrenocarcinoma humano. | TG 456 |
| Ligação a ERs/estrogen receptors | Diretrizes de teste baseadas em desempenho para o receptor de estrogênio recombinante humano (hrER) Ensaios in vitro para detectar produtos químicos com afinidade de ligação ao ER | Dois métodos validados para testar a capacidade de produtos químicos se ligarem ao ERα. – Freyberger-Wilson Ensaio de ligação de ER in vitro baseado em ERα recombinante humano de comprimento total – Instituto de Avaliação e Pesquisa Química (CERI) Ensaio de ligação de ER in vitro baseado em proteína de domínio de ligação de ligante recombinante humano | TG 493 |
| Ativação ou inibição do gene repórter ligado ao ER | Diretrizes de teste baseadas em desempenho para ensaios in vitro de transativação transfectada de forma estável para detectar agonistas e antagonistas do receptor de estrogênio (ER STTA) | Dois métodos validados para detectar substâncias que se ligam a hER levando à transcrição de genes responsivos ao estrogênio usando diferentes linhagens celulares: – Ensaio TA transfectado de forma estável usando a linha celular (h) ERα-HeLa-9903 – Ensaio VM7Luc ER STTA usando uma variante da linha celular MCF7 Ambas as linhas de células humanas transfectaram de forma estável com luciferase como gene repórter. | TG 455 |
Receptor de andrógeno (AR), receptor de estrogênio (ER).
4 . Desafios na previsão de resultados de efeitos in vivo a partir de dados de métodos de teste não animais
Embora os métodos de ensaio alternativos sejam essenciais para os ensaios atuais e futuros de substâncias químicas, eles também apresentam algumas deficiências que devem ser cuidadosamente consideradas. Proeminentemente, é difícil imitar a complexidade de animais de ordem superior usando ensaios baseados em células. Isso inclui fatores como ADME, interações célula-célula e célula-órgão, mecanismos de feedback local e sistêmico, mas também aspectos temporais. Nos organismos vivos, principalmente durante o desenvolvimento, moléculas e células podem ter funções diferentes em diferentes estágios da vida. Teoricamente, isso pode ser modelado por métodos alternativos, mas requer que saibamos o que modelar em primeiro lugar. E para isso, precisamos de uma sólida compreensão fundamental dos mecanismos de ação.
Mesmo com a via de sinalização androgênica bem caracterizada no desenvolvimento reprodutivo masculino, prever efeitos in vivo a partir de dados in vitro pode ser um desafio. Vários estudos mostraram que, infelizmente, os ensaios in vitro nem sempre predizem fielmente os efeitos adversos in vivo. Conforme ilustrado na Fig. 1, a via de sinalização dos andrógenos – simplificando – envolve várias etapas importantes, começando com a síntese de testosterona pelos testículos fetais. Após a secreção, a testosterona pode atuar diretamente no AR, ou ser convertida localmente no ligante AR mais potente diidrotestosterona (DHT) para garantir a masculinização dos tecidos-alvo. Esses passos importantes podem ser medidos por ensaios in vitro para testar o potencial de substâncias químicas de interferir em qualquer um desses processos. Mas mesmo quando estudos in vitro mostram inibição potente da síntese de testosterona, inibição potente na formação de DHT ou inibição potente da atividade de AR, nem sempre observamos efeitos adversos in vivo. Da mesma forma, quando observamos efeitos adversos, a potência in vivo dos produtos químicos pode ser difícil de determinar, uma vez que os estudos às vezes mostram grande variabilidade nas doses de efeito nos mesmos desfechos de efeitos adversos, como por exemplo para os desfechos sensíveis a andrógenos AGD e NR como anteriormente revisado ( Schwartz et al., 2021 ; Schwartz et al., 2019).
FIGURA 1
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Fig. 1. A via canônica de sinalização androgênica envolvida no desenvolvimento reprodutivo masculino e sua vulnerabilidade à disrupção endócrina. Durante o desenvolvimento, as células de Leydig dos testículos fetais produzem testosterona por esteroidogênese. A testosterona é liberada na circulação e atua como ligante para o receptor androgênico (AR) diretamente nos tecidos-alvo localizados próximos aos testículos (por exemplo, ductos de Wolff). Em tecidos mais distantes (por exemplo, genitália externa), a testosterona pode ser convertida no ligante AR mais potente diidrotestosterona (DHT) pela enzima catabolizante 5α-redutase, que induz tecidos sensíveis a andrógenos a se diferenciarem em fenótipos masculinos. Produtos químicos com potenciais antiandrogênicos podem interromper a sinalização de andrógenos em várias etapas-chave da via, levando aos mesmos resultados adversos.
Para exemplificar melhor: dois estudos recentes ilustram claramente como a potência in vitro para o antagonismo de AR pode falhar em prever resultados in vivo. No primeiro estudo, dados de mais de 250 estudos foram usados para testar a capacidade de usar valores de ED50 (dose efetiva mediana) para antagonismo AR in vitro para prever resultados do ensaio Hershberger in vivo ou efeitos sobre AGD em ratos machos (Gray et al. ., 2020). No geral, o poder preditivo dos valores de AR in vitro mostrou-se pobre (menos de 5% de precisão), enquanto as previsões de valores de Hershberger ED50 para AGD masculino tiveram melhor poder preditivo (cerca de 85% de precisão). O segundo estudo, da mesma equipe de pesquisa, comparou a efeitos in vitro e in vivo de pirifluquinazona (PFQ) e bisfenol C (BPC) relacionados ao antagonismo de AR e malformações reprodutivas masculinas, incluindo AGD/anogenital distance=distância anogenital e NR/nipple retention=retenção de mamilo (Gray et al., 2019). PFQ exibiu antagonismo AR fraco in vitro, mas induziu efeitos marcantes in vivo com uma resposta muito potente em NR (9-10 mamilos) e AGD (diminuído em 33%). BPC, por outro lado, apresentou forte antagonismo AR in vitro , mas não induziu efeitos significativos em NR ou AGD. Os autores propõem que a incorporação de dados toxicocinéticos e toxicodinâmicos em extrapolações quantitativas in vitro para in vivo (QIVIVE/quantitative in vitro to in vivo extrapolation) poderia melhorar o poder preditivo de dados in vitro , principalmente melhorando os modelos (IVIVE/in vitro to in vivo extrapolation) de gravidez para prever as concentrações fetais (Gray et al., 2019 ; Gray et al., 2020). E, de fato, isso foi demonstrado em um estudo separado usando dados de vários estudos de toxicidade in utero em ratos sobre produtos químicos antiandrogênicos. Ao incorporar modelagem toxicocinética de base fisiológica (PBTK/physiologically-based toxicokinetic), os níveis reais de exposição fetal podem ser previstos com precisão relativamente alta, assim como um AGD masculino curto para certos produtos químicos (Scholze et al., 2020). Notavelmente, no entanto, esses modelos aprimorados também falharam em alguns casos nas previsões de AGD masculina, destacando o fato de que os modelos preditivos ainda precisam de melhorias, apesar de nosso bom conhecimento básico sobre como a sinalização androgênica está controlando o desenvolvimento reprodutivo masculino. Claramente, temos algum caminho a percorrer antes que possamos prever com segurança efeitos adversos complexos in vivo apenas com dados de métodos de teste alternativos, mas estamos nos movendo na direção certa.
O caso da AGD também pode ser usado para ilustrar a importância de delinear o conhecimento espaço-temporal antes de elaborar estratégias alternativas de métodos de teste. Como já mencionado, uma AGD encurtada é um biomarcador amplo e retrospectivo para ação incompleta de andrógenos durante o desenvolvimento fetal e pode ser induzida por diferentes mecanismos de ação e, mais importante, está associada a vários outros distúrbios reprodutivos masculinos (Schwartz et al., 2019 ; Welsh et al., 2008). Conforme ilustrado na Fig. 1, alguns produtos químicos podem induzir distúrbios reprodutivos masculinos (incluindo um curto AGD) por perturbar a síntese de testosterona pelos testículos fetais. No entanto, como mencionado acima, a perturbação química também pode ocorrer por outros mecanismos. Por exemplo, a síntese de DHT a partir de testosterona pode ser bloqueada nas células-alvo por produtos químicos que inibem a atividade da 5α-redutase ou antagonizando diretamente o AR. Os métodos de teste alternativos devem, portanto, abranger todos os mecanismos possíveis subjacentes aos mesmos resultados adversos ou relacionados. Então, como isso se estende ao desenvolvimento de novos métodos ou estratégias de teste para efeitos adversos na reprodução masculina?
Ao procurar novos biomarcadores de efeitos com base no conhecimento mecanicista e usá-los para desenvolver novos ensaios de teste, a espaço-temporalidade deve ser cuidadosamente considerada. Ftalatos e outros compostos que reduzem a síntese de testosterona em fetos de ratos e subsequentemente causam resultados adversos, como AGD curto, foram relatados como deixando uma pegada transcricional específica nos testículos fetais (Gray et al., 2021 ; Hannas et al., 2011). No contexto correto, tal pegada poderia ser usada para examinar a capacidade de produtos químicos de inibir a síntese de testosterona e causar distúrbios reprodutivos masculinos usando, por exemplo, ensaios celulares ou organoides. No entanto, outros produtos químicos que induzem distúrbios reprodutivos masculinos não deixam necessariamente a mesma pegada transcricional nos testículos, pois podem interferir na sinalização de andrógenos em diferentes etapas da via. Por exemplo, o fungicida triticonazol pode inibir a esteroidogênese e a atividade do AR/androgen receptor, e a exposição fetal leva a uma curta AGD masculina (Draskau et al., 2019). No entanto, ao analisar o transcriptoma dos testículos fetais, poucas alterações são observadas (Draskau et al., 2021) e, portanto, o triticonazol não teria sido sinalizado como potencialmente prejudicial se dependesse de alterações transcricionais no testículo fetal. Ao analisar o transcriptoma dos tecidos genitais sensíveis ao andrógeno, no entanto, observam-se alterações marcantes no transcriptoma (Draskau et al., em preparação) Este é apenas um caso único para exemplificar a importância de olhar para o lugar certo na hora certa ao elucidar mecanismos de ação para desfechos apicais in vivo e usar esse conhecimento para desenvolver métodos alternativos simplificados.
Outro desafio predominante com a previsão de resultados de efeitos in vivo causados por EDCs é o potencial envolvimento de modalidades não EATS/estrogen, androgen, thyroid, and steroidogenesis na indução de efeitos de EDCs. Essa lacuna potencial no conhecimento e nos ensaios de teste foi destacada pela OCDE já há uma década (OECD, 2012) e recentemente reiterada no contexto do desenvolvimento de estratégias de testes robustas com maior dependência de métodos de teste alternativos (Martyniuk et al., 2021). Mas, apesar disso, nossa compreensão de como as modalidades não EATS podem contribuir permanece muito limitada, principalmente em relação às substâncias químicas avaliadas sob o documento de orientação atual do EDC, como, por exemplo, aquelas regulamentadas pelo regulamento REACH/Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals da União Europeia. Existem várias modalidades potenciais não EATS e sete foram sugeridas como sendo de particular relevância para os efeitos da disfunção erétil, incluindo vitamina D, sinalização do receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR/peroxisome proliferator-activated receptor) e sinalização de retinóides (OECD, 2012).
A via de sinalização dos retinóides recebeu maior atenção na avaliação e regulação de risco químico nos últimos anos, com evidências emergentes sugerindo que a via é vulnerável a disruptores endócrinos e um provável contribuinte para distúrbios endócrinos humanos (Grignard et al., 2020; Knudsen et al., 2020 ; Martyniuk et al., 2021 ; OCDE, 2012). A sinalização retinóide é essencial para o desenvolvimento normal e está envolvida em vários processos, desde a padronização axial até a organogênese e o desenvolvimento reprodutivo. Por exemplo, nas gônadas (testículos e ovários) de camundongos, a presença de ácido retinóico (RA/retinoic acid) direciona a diferenciação oportuna das células germinativas, regulando a entrada meiótica.Spiller & Bowles, 2019 ). A AR também pode estar envolvida no desenvolvimento somático no testículo fetal, com a presença de AR ectópica impedindo a produção de fatores essenciais de masculinização, como hormônio anti-Mülleriano (AMH) e fator 3 semelhante à insulina (INSL3) que instruem o desenvolvimento do sistema reprodutor masculino , bem como enzimas esteroidogênicas necessárias para a síntese de testosterona ( Bowles et al., 2018 ). Os dados de humanos ainda são escassos, mas o AR/androgen receptor parece também estar envolvido no desenvolvimento adequado do testículo humano (Jørgensen et al., 2015). Este é apenas um exemplo de como as modalidades não EATS podem contribuir potencialmente para resultados adversos. Assim, qualquer estratégia de teste robusta que dependa principalmente de dados de testes não animais também pode incluir modalidades relevantes não EATS; modalidades que ainda não foram estabelecidas para a maioria dos desfechos relacionados à disfunção erétil.
5 . Usando a estrutura da via de resultados adversos para auxiliar nas avaliações de produtos químicos ED/Endocrine Disruptors
Como mencionado na seção 2, o teste e a avaliação de produtos químicos para propriedades ED representam o desafio de estabelecer um nexo causal plausível entre resultados adversos e modos de ação endócrinos. Este critério pode acarretar uma alta carga de trabalho para os avaliadores de risco, pois a quantidade de informações a serem coletadas e analisadas pode ser muito extensa. Construir casos para relações causais plausíveis também requer conhecimento especializado em campos especializados de pesquisa, algo que pode ser muito desafiador para avaliadores de risco que operam em muitos campos biológicos diferentes. Para resolver isso e questões relacionadas, a estrutura da via de resultado adverso (AOP/adverse outcome pathway) é uma ferramenta promissora que pode ajudar muito os avaliadores de risco, (Ankley et al., 2010). O conceito AOP também se alinha bem com os critérios para identificação de DE, principalmente porque fornece ligações biologicamente plausíveis entre eventos a montante e resultados de efeitos adversos apicais em organismos intactos.
Essencialmente, uma AOP descreve uma sequência de eventos desde o estressor de iniciação, ou evento iniciador molecular (MIE/molecular initiating event), até um resultado adverso (AO/adverse outcome) em um organismo intacto (Ankley & Edwards, 2018 ; OECD, 2018c). Todas as etapas intermediárias entre a MIE e AO são entendidas como eventos-chave (KEs/key events) e apenas os eventos que são essenciais para progredir na via causal devem ser incluídos (OECD, 2018c ; Villeneuve et al., 2014). Finalmente, esses ‘eventos' individuais (MIE, KE, AO) são ligados por relações de eventos chave (KERs), que são unidades de conhecimento a partir das quais a causalidade é inferida (Svingen et al., 2021 ; Villeneuve et al., 2014). Dessa forma, um AOP abrange vários níveis de organização biológica e o conteúdo depende da extensão da informação biológica existente para o AOP específico. Portanto, o conceito AOP fornece uma estrutura quase adequada para as avaliações de ED, pois:
i) define um AO em organismos intactos,
ii) descreve um modo de ação, e
iii) estabelece uma ligação biologicamente plausível entre o modo de ação e o AO (Audouze et al., 2021).
Outra vantagem da estrutura AOP é que ela pode ajudar a identificar onde precisamos desenvolver ou melhorar métodos de teste não animais relevantes para testes e avaliações químicas. As AOPs podem ser suficientemente descritas para que as primeiras KEs possam ser usadas com mais certeza na previsão de desfechos de efeitos apicais relevantes para a regulação química (Ankley & Edwards, 2018). Em relação à avaliação de risco para a saúde humana, os AOP podem ajudar no uso de testes de triagem relativamente simples para apoiar a associação com efeitos adversos à saúde e, assim, levar a avaliações mais rápidas e eficientes de substâncias químicas, pois potencialmente podem evitar a necessidade de uso de animais que demandam recursos. experimentos e, em vez disso, usar o conhecimento existente para superar as lacunas de dados para inferir causalidade. Finalmente, os AOPs também são previstos para ajudar na avaliação do risco de misturas, pois podem ser usados para agrupar substâncias para as quais as informações disponíveis estão incompletas, como mostrado recentemente com um estudo em ratos sobre misturas de EDCs com modos de ação estrogênicos ou antiandrogênicos. -ação (Christiansen et al., 2020).
6 . Orientação atual para avaliar uma substância por ter propriedades ED
A razão para elucidar os mecanismos de ação, ou desenvolver métodos de teste alternativos ou AOPs, é auxiliar na avaliação de risco químico e, ao fazê-lo, proteger melhor os seres humanos ou o meio ambiente dos efeitos nocivos causados pela exposição. Isso significa que tais empreendimentos só têm valor real se forem implementados em marcos regulatórios internacionais. Assim, antes de concluir, abordaremos brevemente a situação atual para testar e regular os EDCs. O fato é que os EDCs são atualmente regulamentados na União Europeia e em muitos outros países, mas ainda há um debate em andamento sobre a melhor forma de avaliar e possivelmente classificar essas substâncias. Além disso, agências e indústrias contam com diretrizes de teste da OCDE reconhecidas internacionalmente para implementar a regulamentação, por exemplo, aquelas mencionadas na seção anterior. Documentos de orientação que descrevem como executar essas diretrizes estão disponíveis; O Documento de Orientação 150 sobre Diretrizes de Teste Padronizadas para Avaliação de Produtos Químicos para Disrupção Endócrina é o recurso mais relevante (OCDE, 2018b).
Em 2018, a Comissão da UE publicou critérios para avaliar as propriedades ED de produtos biocidas e fitofarmacêuticos (BP/PPPs/properties of biocidal and plant protection products) (nt.: ou seja, os AGROTÓXICOS) com o objetivo de reduzir a exposição humana a EDCs. Dentro da UE, todos os BP/PPPs agora exigem, por lei, que sejam avaliados por suas propriedades potenciais de ED (nt.: IMPORTANTÍSSIMO SABERMOS DISSO!! AGORA OS AGROTÓXICOS E ‘DOMISSANITÁRIOS', NA UNIÃO EUROPEIA, PRECISAM SER AVALIADOS SE SÃO OU NÃO DISRUPTORES ENDÓCRINOS). Para auxiliar nesse mandato de avaliação, a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA/European Food Safety Authority) e a Agência Europeia de Produtos Químicos (ECHA/European Chemicals Agency) prepararam um extenso documento de orientação para os usuários finais (EFSA/ECHA et al., 2018). O objetivo deste documento é fornecer orientação técnica para a implementação dos critérios de ED. Embora desenvolvida especificamente para BP/PPPs, esta orientação também pode ser adotada de forma mais ampla, incluindo também substâncias químicas não BP/PPP, como recentemente exemplificado para butilparabeno (Boberg et al., 2020). É importante ressaltar, no entanto, que a avaliação real de produtos químicos usando este e outros documentos de orientação ainda exige o estabelecimento de vínculos biologicamente plausíveis entre os modos de ação do ED e os resultados adversos relacionados à disrupção endócrina, algo que requer conhecimento a priori sobre as vias causais.
Após a implementação dos critérios ED no quadro regulamentar europeu, apenas um número muito limitado de compostos foi identificado como disruptor endócrino para a saúde humana; e apenas ações regulatórias limitadas tomadas com base nessa identificação. Desde 2018 até o momento da redação (março de 2022), apenas 5 produtos químicos REACH foram identificados como substâncias de alta preocupação (SVHC/substances of very high concern) no que diz respeito às suas propriedades de desregulação endócrina com base nas modalidades EATS (ECHA, 2022 ; ED_List, 2022 ; Lynch et al. , 2017). A ação antiandrogênica demonstrou ser o principal modo de ação que leva aos efeitos reprodutivos adversos em apenas um caso (diciclohexiftalato; DCHP), enquanto a ação estrogênica demonstrou ser o principal modo de ação do butilparabeno , 4-MBC, Bisfenol B e dodecilfenol (PDDP). Durante o mesmo período, apenas um agrotóxico foi regulamentado com base em suas propriedades de desregulação endócrina: o fungicida mancozeb foi banido devido às suas propriedades perturbadoras do sistema hormonal da tireoide ( EFSA et al., 2019). Este número muito limitado de produtos químicos regulamentados com base em propriedades de desregulação endócrina exemplifica claramente que os critérios EDC da UE são de fato muito rigorosos e que uma quantidade substancial de evidências é necessária para que a ação regulatória ocorra. Como esses aspectos regulatórios serão tratados à medida que avançamos em direção a uma maior dependência de métodos de teste alternativos e menos estudos em animais, continua a ser visto.
7 . Perspectivas e conclusão
Possuímos uma sólida compreensão de como os hormônios e o sistema endócrino regulam o desenvolvimento e a função reprodutiva masculina em animais e humanos. Também temos uma boa compreensão de quantos produtos químicos podem interferir nas biomoléculas e nas vias regulatórias. Temos até um extenso banco de dados sobre como um número considerável de produtos químicos causa várias doenças reprodutivas masculinas em animais experimentais (Brehm & Flaws, 2019 ; Gray et al., 2001 ; Schwartz et al., 2021 ; Schwartz et al., 2019). Em humanos, as evidências são menos claras e ainda debatidas, mas muitos estudos epidemiológicos associam exposições químicas a doenças comparativas àquelas observadas em modelos animais (Bonde et al., 2016 ;Kristensen et al., 2016 ; Rodprasert et al., 2021 ; Skakkebæk et al., 2022 ; Stukenborg et al., 2021). No entanto, nossa capacidade de prever adversidades in vivo com base em dados de métodos de teste alternativos está longe de ser infalível. Devemos, no entanto, nos esforçar para melhorarmos nossa capacidade de prever resultados de efeitos in vivo a partir de métodos de teste alternativos e, assim, reduzirmos bastante nossa dependência de testes em animais para fins de avaliação de risco químico. Mas é um desafio considerável, principalmente no que diz respeito à desregulação endócrina, pois o sistema endócrino é um desafio para imitar in vitro ou in silico. Para ajudar com isso, provavelmente precisamos desenvolver estratégias de teste sofisticadas que incluam métodos de teste não animais que estejam muito próximos da situação in vivo, pois confiar em eventos-chave contra a corrente simplistas, como interações com receptores nucleares, não será suficiente. Também precisamos garantir que os ensaios sejam relevantes para o que buscamos proteger, seja a vida selvagem ou os seres humanos.
A toxicidade reprodutiva masculina representa potencialmente o campo ED para o qual temos mais conhecimento mecanicista e os ensaios de teste mais estabelecidos. O desafio então para outros campos de ED – por exemplo, reprodução feminina, distúrbios metabólicos e neuroendocrinologia – é óbvio. Aqui, como na reprodução masculina, prevemos grandes avanços tanto no estabelecimento de uma nova compreensão mecanicista sobre as vias moleculares causais quanto no desenvolvimento de métodos alternativos de teste. Por exemplo, as metodologias de células-tronco humanas são muito promissoras no contexto da identificação de perigos químicos e avaliação de riscos e testemunharão avanços significativos nos próximos anos. Isso incluirá células-tronco embrionárias (ESCs/embryonic stem cells) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs/induced pluripotent stem cells), ambas já usadas em testes de toxicidade. As células-tronco multipotentes também compartilham muitas das mesmas características que hiPSCs e ESCs e provavelmente serão exploradas ainda mais, apesar de representarem células mais especializadas do que células pluripotentes. Por enquanto, no entanto, uma melhor consistência entre os ensaios de células-tronco e animais intactos deve ser alcançada antes que eles possam substituir com segurança os estudos de toxicidade em animais (Trosko e Chang, 2010).
Com relação à endocrinologia, ensaios complexos que se assemelham a uma situação in vivo podem precisar ser complexos em design, e aqui os organoides podem ser de grande valor. Novamente, provou-se um desafio estabelecer organoides, ou sistemas baseados em células que podem capturar fielmente órgãos endócrinos, como gônadas, mas avanços recentes mostram grande promessa, como, por exemplo, organoides testiculares diferenciados de iPSCs humanos (Knarston et al., 2020). Nesse ínterim, sistemas de cultura de órgãos de explantes (nt.: célula, tecido ou órgão de uma planta usado para iniciar culturas in vitro), tanto de animais quanto de tecidos humanos, podem ser de grande ajuda tanto em testes químicos quanto na caracterização de mecanismos de ação importantes que precisam ser incorporados nas estratégias de testes.
Para concluir, os testes químicos modernos devem passar a depender menos dos estudos de toxicidade animal para identificação de perigos químicos, avaliação de riscos e regulamentação internacional; no entanto, não deve ser um grande gasto para a saúde humana, nem ambiental. O fato é que há certas coisas sobre um sistema complexo, como um ser humano, que não podem ser totalmente replicadas ou previstas por abordagens reducionistas. Na maioria dos casos, o todo é maior que a soma de suas partes. O que devemos almejar é elaborar estratégias de teste que permitam previsões adequadas de adversidades em organismos complexos. Isso deveria ser um objetivo, mas ainda não estamos totalmente lá, pelo menos não no que diz respeito ao sistema reprodutor masculino e ao envolvimento da desregulação endócrina.
Declarações dos autores
Terje Svingen : Conceituação, Aquisição de fundos, Visualização, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição.
Camilla Schwartz : Conceituação, Redação – rascunho original.
Anna K. Rosenmai : Conceituação, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição.
Louise Ramhøj : Conceituação, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição.
Hanna KL Johansson : Conceituação, Redação – rascunho original.
Ulla Hass : Conceituação, Redação – revisão e edição.
Monica K. Draskau : Conceituação, Redação – rascunho original.
Nichlas Davidsen : Conceituação, Redação – rascunho original.
Sofie Christiansen: Conceituação, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição.
Anne-Sofie R. Ballegaard : Conceituação, Redação – rascunho original.
Marta Axelstad : Conceituação, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição.
Financiamento
Este trabalho recebeu financiamento da Agência de Proteção Ambiental Dinamarquesa (‘Miljøstyrelsen'), Dinamarca . A agência financiadora não teve qualquer influência sobre o conteúdo da revisão ou decisão de publicação.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
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